基于拉曼光谱的无标记细胞鉴定技术在高产细胞自动化筛选中的应用

在生物制品研发过程中，基因修饰细胞系常被用于高效地生产治疗性蛋白质。然而，高产细胞克隆的筛选及此类细胞系的规模扩大是一项极为耗时且成本高昂的流程。自动化识别并筛选高效生产的单克隆细胞，能够显著加快这一进程。

在生物制品研发过程中，基因修饰细胞系常被用于高效地生产治疗性蛋白质。然而，高产细胞克隆的筛选及此类细胞系的规模扩大是一项极为耗时且成本高昂的流程。自动化识别并筛选高效生产的单克隆细胞，能够显著加快这一进程。

OptisCell流程旨在将细胞系鉴定所需时间从12个月缩短至3个月。该技术采用拉曼光谱技术对产蛋白细胞进行无标记功能鉴定，随后通过基于激光的单细胞转移流程分离目标细胞。这一创新减少了生产效率不足的细胞克隆的扩增与培养步骤，相比传统流程，能更早筛选出适用于生物技术生产的候选细胞。此外，OptisCell的自动化流程链还支持大量候选细胞的筛选，并可精准追踪整个过程，为后续质量控制提供保障。

OptisCell流程的第一步的是利用HoloSpec拉曼光谱仪分析细胞池中的单个细胞，检测其特定蛋白质的生产情况。该系统通过机器学习算法区分产蛋白细胞与非产蛋白细胞的拉曼光谱。第二步则是借助激光脉冲将高产细胞转移至微量滴定板中。

这一转移过程被称为激光诱导前向转移（LIFT）：激光脉冲使载体上的吸收层汽化，产生的微小气泡在介质（如水凝胶）中形成射流，从而将选定的细胞转移至微量滴定板。该流程链可快速、自动地识别高产细胞，并从细胞池中筛选出来进行后续培养。OptisCell流程腔室的示意图如图1所示。

图1：拉曼光谱分析与LIFT流程腔室示意图，以微量滴定板作为接收装置，盖玻片作为转移载体。

方法

为验证高产细胞自动化鉴定的可行性，弗劳恩霍夫界面技术与生物工程研究所（Fraunhofer IGB）提供了产β干扰素的中国仓鼠卵巢细胞（CHO dhlr-INFβ）的现有拉曼光谱，由弗劳恩霍夫应用信息技术研究所（Fraunhofer FIT）通过其机器学习软件进行分析。潜在高产细胞的拉曼光谱首先经过预处理，以去除其中的干扰信号——例如宇宙射线尖峰、白噪声及其他背景信号。

随后通过主成分分析（PCA）降低特征维度，并采用四个带有加权方法的独立模型判断哪些光谱对应的细胞为高产细胞。

为验证OptisCell设备内置拉曼光谱仪的性能，对直径为8μm的荧光微球（Dragon Green Fluorescent Polymer Microspheres FSDG007, Bangs Laboratories, Inc.）进行了分析。

首先制备转移载体：通过刮涂法在盖玻片上形成50μm厚的明胶层（5% gelatin from bovine skin, G9391, Sigma Aldrich），并将荧光微球涂覆在水凝胶层表面。让悬浮液在转移载体上静置4分钟，使微球沉降，之后去除多余悬浮液，将转移载玻片放入OptisCell设备中。使用10倍物镜（MSPlan 10, NA 0.3, Olympus）扫描转移载玻片，定位用于拉曼分析的孤立荧光微球。拉曼光谱的采集采用共聚焦拉曼配置，包括785 nm激光源（iBeam smart 785‐S‐WS, Toptica）、50倍物镜（50x MPlanFL N, NA 0.8, Olympus）和HoloSpec光谱仪（HoloSpec f/1.8i – NIR, LOT with iDus 416 CCD, Andor）。光谱采集完成后，对其进行预处理，包括光谱归一化和背景信号扣除。

图2：通过OptisCell系统拉曼光学装置拍摄的荧光微球图像。

结果

我们通过OptisCell系统能够精准定位单个微球，并利用HoloSpec拉曼光谱仪对其进行测量，典型光谱如图3所示。无需复杂的信号处理，即可清晰识别出荧光微球中聚苯乙烯的特征峰。利用潜在高产细胞的预录拉曼光谱进行产蛋白细胞自动化检测时，真高产细胞的识别准确率最高可达92%。典型结果如图4所示：在26个细胞的光谱中，机器学习软件成功识别出单个产蛋白细胞的光谱。

图3：单个荧光微球的拉曼光谱，显示出微球中聚苯乙烯的特征峰。

结论

OptisCell系统是一款用于高效开发产蛋白细胞系的设备，兼具省时与成本优势。研究表明，OptisCell系统的内置拉曼光谱仪能够对小型目标物进行分析，并获得足够强度的拉曼信号。此外，通过拉曼光谱实现产蛋白细胞的自动化检测时，真高产细胞的识别准确率最高可达92%。

在后续研究中，将把产蛋白细胞的自动化检测功能整合到OptisCell系统中，实现全流程的一体化操作。

图4：25个低产或不产蛋白细胞（蓝色）与1个高产细胞（红色）的拉曼光谱。右上角为经主成分分析（PCA）降维后的特征空间。